ELISA实验指南（5）之夹心法ELISA

夹心法ELISA

夹心ELISA可分为直接夹心ELISA和间接夹心ELISA两大体系。

1.直接夹心ELISA

    直接夹心ELISA如下图和图3所示。

      直接夹心ELISA，涉及抗体与固相(阶段i和阶段ii )的被动附着。这些抗体(捕获抗体)然后结合第iii阶段加入的抗原( s )。将抗原( s )稀释于阻断缓冲液中，避免非特异性附着于固相。在这里，阻断缓冲液的成分不应含有任何可能与捕获抗体结合的抗原。孵育洗涤后，在固相(阶段iv )上附着一抗原抗体复合物。

Fig. 3.  Direct sandwich ELISA. This system exploits antibodies attached to a solid phase to capture antigen. The antigen is then detected using serum specific for the antigen. The detecting antibody is labeled with enzyme. The capture antibody and the detecting antibody can be the same serum or from different animals of the same species or from different species. The antigen must have at least two different antigenic sites.

    然后通过在阻断缓冲液(阶段v )中加入和孵育酶标记的特异性抗体来检测捕获的抗原(有时称为捕获)。因此，这是直接与捕获抗原上的抗原靶点结合。这种二抗可与捕获所用的二抗相同，也可就其产生的特定动物来源或种类而异。孵育洗涤(阶段vi )后，加入底物/色原(阶段vii )，形成结合酶，然后停止(阶段viii )，最后用分光光度计读取(阶段ix )。

由于采用了单一的酶偶联抗体，因此该系统仅限于该特定抗体集合所固有的特异性和性质。这就限制了ª测试的通用性，例如，所使用的每一种抗体制剂都必须标记(针对不同的抗原)与直接ELISA一样，只限于单一抗体制剂。

同样，系统还受到限制，因为抗原必须至少有两个抗原位点(表位)，因为捕获抗体和检测抗体都需要结合。这样可以将检测限限制在相对较大的抗原复合物上。

    捕获抗体(在固相上)和检测抗体可以针对某一抗原复合物上的不同表位。这有助于抗原分子的定向，使检测抗体结合的机会增加。使用不同的检测抗体和共同捕获抗体来研究抗原制剂之间的微小差异也是一个好处，因此在下面间接夹心法ELISA2中讨论了更多的通用系统。使用完全相同的抗体进行捕获和检测(如mAbs )会导致检测器可用结合位点严重受限的问题。抗原靶点上表位的大小和空间关系(地形)也至关重要，可极大地影响检测。

2. 间接夹心法 ELISA

    间接夹心ELISA示意图如图4所示。间接夹心ELISA检测阶段i-iv与直接夹心ELISA相同。因此，抗体被动地附着在固相上，捕获抗原。然而，第v阶段涉及添加检测抗体。在这种情况下，抗体不加酶标。在孵育和洗涤(阶段vi )后，通过加入和共孵育酶标记的抗种属抗体(阶段vii )来确定检测抗体的量。然后按其他系统(阶段xiii-ix )中描述的步骤来操作。

    这种检测方法的优点是，只要产生抗体的种类与捕获抗体不相同，可在捕获抗原中加入任意数量的不同来源的抗体(样品)。更具体地说，酶偶联的抗种属抗体不与捕获抗原所用的抗体发生反应。如果采用免疫化学技术来选择和产生特定形式的抗体，并注意所使用的酶结合物的特异性，就可以使用同一种类的抗体。因此，作为例子，捕获抗体可以被加工成不含Fc部分的二价分子(又称F(ab') 2部分)。检测到的抗体可以未经处理。然后，酶结合物可能是Ig分子的抗种属抗体的抗Fc部分。因此，该偶联物只会与含有Fc的抗体发生反应(因此不会与捕获分子发生反应)。设计这类检测方法的需要取决于现有的试剂。

Fig. 4.  Indirect sandwich ELISA. The antigen is captured by a solid-phase antibody. Antigen is then detected using antibodies from another species. This in turn is bound by an antispecies conjugate. Thus, the species of serum for the coating and detecting antibodies must be different; the antispecies cojugate cannot react with the coating antibodies.

    然而与多克隆血清相比，单克隆抗体具有理想的特异性，或者说，人们希望筛选出大量针对必须捕获的抗原的单克隆抗体(可能是在低浓度或其他抗原的混合物中)。在这种情况下，F(ab')2多克隆血清的使用是不成功的，因此，为捕获抗体制备片段是值得的，事实上，为这个目的提供了相对容易使用的试剂盒。使用市售的抗鼠药Fc完成要求。

声明：本文引用自The ELISA Guidebook一书，欢迎转发分享，一起学习进步。