1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别
1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a． 分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b． 稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有 3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c． 基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d． 纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。
1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：
a． 分子量太小
b． 一般只含有一个抗原决定簇
c． 纯度高
d． 稳定性差
由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就 HCV ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是 HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了 HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的 HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。
由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量 ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。
2．假阳性本底产生的原因
2.1 抗原因素
2.1. 1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。
2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的 HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。
2.2. 3 抗原纯度对特异性的影响。以 HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的 HCV 抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为 100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.2 人血清中的正常 IgG
人血清中 IgG 的浓度对 HCV 试剂盒有较大的影响。HCV 试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有 IgG 结合，而 IgG 吸附于板孔的能力很强，因此我们采用 100 微升样稀加 10 微升血清来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的 IgG 为 12mg/ml，而有些人的 IgG 浓度会远远高于此，这部分人的血清经 ELISA 反应后往往会显色。
2.3 人血情中异常的 IgG 结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它
异常 IgG（IgG 浓度达到 50mg/ml）会引起本底升高或假阳性。
2.4 溶血的影响当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通
过吸附或“PP 效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化 A、B 液显色而造成假阳性。
2.5 操作不当引起
任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键核基础。
2.5.1 加样
2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的 IgG 均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。
2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为 120μl。如果加入的酶多于 120μl 或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.5.1.3 可能原因：
① 血清或血浆标本分离不好即进行加样;
② 手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时);
③ 加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决办法：
① 标本为血清：较好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟;若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
② 加样后及时放入孵箱。
③ 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
④ 如果采用AT或其他全自动加样，较好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
⑤ 标本较多时，请分批操作。
2.5.2 温育
2.5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
2.5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为 37 度，在这个温度下放置 30 分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。
2.5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。
2.5.3 洗板
可能原因：
①采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
② 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底;洗板针堵塞，抽吸不完全;洗板不畅，导致洗板效果差。
③ 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决办法：
① 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后较好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;
② 合理安排，或多用几台洗板机。
2.5.4 显色
可能原因：
① 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;
显色剂时溅出孔外造成液体回流。
解决办法：
① 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用;
② 加样时保持显色剂不外流;
③ A、B液应避免接触金属器械。
2.5.5 终止
可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。
2.5.6 读板
如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。
所以在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。
